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纳米光学及其益处:可能的实验

摘要

迫切需要生产靶向给药载体,以便有效治疗,尤其是在治疗致癌细胞方面。目前的建议设想利用现代光学成像技术,研究不同癌细胞类型中形状和大小特定颗粒的细胞内化途径。“采用自上而下的颗粒制造技术来制造单分散的亚微米圆柱形颗粒。通过多种生物成像技术,如共焦显微镜、流式细胞术和透射电子显微镜,监测细胞内植入的印刷颗粒。”(Moriyama1等人,2008年)通过一系列实验,发现药物载体在癌细胞内的内化是由于网格蛋白介导的内吞作用和大颗粒细胞的内吞作用,其中一些颗粒呈小窝介导的内吞途径。在大多数细胞中,颗粒的表面电荷在融合过程中起主要作用,并对内化速率起主导作用。实验表明,由于颗粒形状的操纵,作为给药载体的颗粒的加入,细胞毒性明显不足。人们发现带正电的粒子在内化方面有更高的效率,这一点通过zeta电位测量得到了进一步验证。研究还发现,荷正电粒子通过多种途径,包括网格蛋白介导的和大粒细胞增多,通过内吞作用在HeLa细胞中,从而成功地利用光学成像技术和光刻技术来产生靶向给药机制。

介绍

纳米技术的最新进展被预测为这样一种现象,即随着我们朝着更小的尺度发展,物理变化的基本规律和这一新兴技术的最新进展,使我们能够使用扫描探针技术、光镊,以及高分辨率电子显微镜(Dilwart,2008)。

近年来,为了解决光学在纳米尺度上的重要问题,人们越来越倾向于纳米科学和纳米技术。Moriyam(2008)的研究表明,由于衍射极限会阻碍光聚焦到更小的尺寸,即小于半个波长,因此不可能将光学成像与纳米尺度特征相互作用。许多科学家进行的研究的目标是“缩小”衍射极限(共焦显微镜),甚至克服它(近场显微镜)。她还指出,除了粒子的外在尺寸外,其内在特性也容易发生变化,而且随着纳米尺度的临近,副作用也会变得更加突出。纳米生物医学研究中的光学检测系统被用来研究正常组织和癌组织在光学特性方面的自然差异。然而,如果使用靶向的光学活性剂,它们将进一步提高光学活检程序的适用性和效率。William(2008)在他的论文中提出了这样一个事实:光被用于成像和记录测量,因此测量时间由于可归因于活体的波动而缩短。他提出,可以通过同时显示估计信号和测量信号来确定待测信号的存在与否。最近对粒子的探索和利用,例如用于体内治疗的纳米载体,已经大大提高了不同癌症和药物治疗方法的效率。

詹妮弗和她的同事(2008年)进行了几项与药物输送有关的研究,并针对纳米颗粒的“制造”进行了类似的研究,以用作药物输送载体。不同的药物载体为定点靶向给药的发展创造了新的选择。DeSimone(2007)和他在北卡罗莱纳大学的研究小组一直深入参与纳米颗粒的合成和药物释放机制的监测研究。他展示了一种制备单分散纳米颗粒的独特方法,从而改变了传统的采用湿化学的光刻方法。未来的研究应该集中在控制药物的大小、化学成分、均匀性和靶向给药方面。他还提到,科学家们面临的额外挑战是,药物通过不稳定的封装(因为它们不是稳定的物体),而且对大小和形状几乎没有控制,而且随着时间的推移释放也无法监测。他在光刻研究中增加了一个新的维度,使用非润湿硅模板,采用生物成像超分辨率技术。Rolland(2004)强调需要考虑内在化的途径,正如他在其研究报告中所证明的那样,“网格蛋白介导的、小窝介导的大粒细胞增多在细胞内药物贩运中起着重要作用”。

“荧光显微镜的一个关键优势是它能够通过用光谱上不同的标记标记来绘制两个或多个这些成分的相对分布图”,正如Ellis(Eullis,2006)提出的那样。她还提到,大多数细胞的相互作用发生在局部区域,由于其200纳米的有限分辨率,这些区域太小,无法用常规光学方法进行探测。因此,新的发展包括使用超分辨率多色荧光法。

本研究利用高分子和有机化学、生物化学和细胞生物学,利用一种称为“PRINT”(非润湿模板中的粒子复制)的新型粒子制造方法,结合生物医学成像技术、扫描电子显微镜和,荧光探针检测和追踪药物,并监测其随时间的释放。这项技术很有前途,因为使用的氟尿嘧啶的表面能很低,我们将能够生产出离散的、形状和尺寸特定的单分散粒子,这些粒子可以很容易地用于靶向高效的药物递送方法。我们还将探讨组织培养细胞系产生的人癌细胞(HeLa细胞)中非靶向性柱状产生颗粒的内化机制,然后采用生物成像技术监测药物的掺入和释放。

材料和方法

印刷颗粒的制备将含有0.1%2,2-二乙氧基苯乙酮的20ml氟脲树脂汇集在8〃图案母版(硅片)的中心(具有200nm的特征,或根据需要)。这种晶圆可以购买,也可以从Benchmark Technologies定制。该系统设置在一个封闭的紫外线室中,用氮气吹扫3分钟。然后将其暴露在UV-λ=365nm下;>20兆瓦/厘米2–固化晶圆-通过紫外线能量形成化学交联。“PFPE模具从主模板上轻轻剥离,从硅表面移除。78%(w/w)苯乙氧基w/2%(苯乙氧基w/2)丙烯酸酯单体(小灵通)–混合标签(a) 一。一个单独的小瓶,通过0.22µm PTFE过滤器过滤2-丙醇,—这是(b) 一。将10%(w/v)的(a)与(b)混合-并使用喷枪将1ml该溶液喷在上面制备的氟斑牙图案模具上。然后在8〃模具上放置聚乙烯板,确保覆盖整个活动区域。”(PubMed)——这一过程的一个功能:施加“压力”,使溶液“压入”模具层压。“为了收集颗粒,丙酮首先通过0.22µm PTFE过滤器过滤。使用玻璃载玻片沿模具表面轻轻移动一滴这种过滤过的丙酮。玻璃载玻片的移动促进了颗粒从模具中释放。悬浮颗粒收集在50 ml Falcon管和dil中用过滤过的丙酮稀释至50 ml。将悬浮液涡流10 min,然后以3200 rpm离心30 min。通过旋转10 min,然后再离心30 min,去除上清液并将颗粒颗粒重新分散在50 ml新鲜丙酮中。再次重复此过程,并在抽吸后,将通过超声分散15分钟,将颗粒重新分散在5毫升蒸馏水中,并将颗粒颗粒重新分散在50毫升新鲜丙酮中,以形成10毫克/毫升的最终浓度”(PubMed)

通过zeta电位测量、TEM和共焦激光扫描显微镜对打印颗粒进行分析。

  • Zeta电位测量”用ZetaPlus-Zeta电位分析仪(Brookhaven Instruments Corporation)测定了印刷颗粒的表面电荷。
  • 细胞系与维护HeLa细胞保存在组织培养MS培养基中,MS培养基中添加10%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和非必需氨基酸
  • 共焦激光扫描显微镜将HeLa细胞(50000)接种在T-25烧瓶中24小时(37℃,5%CO2)之后,用PBS清洗细胞三次。然后将细胞培养4小时(37°C,5%CO2)用荧光素标记的印刷颗粒。利用奥林巴斯FV500共焦激光扫描显微镜(Olympus Co Ltd.)对细胞进行可视化观察。透射电子显微镜(TEM)Ⅰ用透射电镜观察了颗粒间的相互作用。细胞用印刷颗粒处理,固定在2%多聚甲醛/2.5%戊二醛/0.15m钠中。用金刚石刀将单层膜平行垂直于基底进行切割。使用一台在80 kV下工作的LEO em910透射电子显微镜对样品进行可视化。使用Gatan Orius SC1000 CCD数码相机和数字显微照片3.11.0(Gatan,Inc.)获得数字图像。
  • 网格蛋白介导的内在化破坏细胞在含有75μM Dynasore的无血清MEM中在37℃/5%CO下培养60分钟2然后在含15μg/ml颗粒的无血清MEM/75μM Dynasore中培养60分钟,然后通过流式细胞仪进行分析。

结果

采用desimone及其同事提出的非润湿技术,获得了离散的单分散印刷颗粒。如图2所示,获得了大小均匀的颗粒,这使得这是一种有效的药物包封技术。图2展示了用于“制造”粒子的流程图。

利用透射电子显微术测定了纳米颗粒的平均尺寸和形貌,其平均宽度为1.00±0.06μm,平均高度为0.68±0.05μm,粒子一侧有一个弯月面,这是由于在硅片上的地板成型造成的。用zeta-Plus-zeta电位分析仪测得正电荷粒子的zeta电位为+23±3mv。粒子内化使用多种技术,包括共焦显微镜、流式细胞术和透射电子显微镜(TEM)观察含有PHS药物的内部印刷颗粒。图1所示为HeLa细胞的共焦显微照片,其中内含的打印颗粒具有正的表面电荷,并且使用TEM技术在HeLa细胞中打印内部颗粒为1μm。

粒子内部化途径采用化学抑制剂研究HeLa细胞对1μm正电荷印刷颗粒的内化途径。“据观察,当菲利平用于抑制内吞作用时,观察到大约2%的内吞减少。”(PubMed)然而,当使用Dynasore进行探测时,观察到效率显著降低,并观察到35%的下降,虽然Dynasore是一种著名的抑制剂,用于通过涂有网格蛋白的凹坑探测内部化。“所获得的结果清楚地表明,打印颗粒内化为HeLa细胞有多种途径,其中主要的途径是网格蛋白介导的内吞作用和大颗粒细胞作用。”

然后进行Dako流式细胞仪测量,以确定细胞在打印颗粒中的百分比,经过一系列彻底的冲洗,以去除任何膜结合或非内化颗粒。“根据颗粒的电荷,发现除了没有观察到优先内化的巨噬细胞系外。”(PubMed)还确定,在100μg/ml的颗粒浓度下,正电荷印刷颗粒被发现内化到几乎所有被分析的HeLa细胞中;相反,我们观察到大约60%的带负电荷的粒子在相似的实验浓度下被内化。如图1所示,颗粒已被内化,所获得的最终结果表明巨噬细胞在印刷颗粒的内化过程中不起重要作用,也不干扰药物的掺入,并且描述了通过HeLa细胞掺入打印颗粒在各自的检测中未观察到显著的细胞毒性。

共焦显微照片描绘了在HeLa细胞内被内化的印刷颗粒图像。
图1:共焦显微照片描绘了在HeLa细胞内被内化的印刷颗粒的图像。
本研究中使用的1μm柱状颗粒的扫描电子显微照片。
图2:本研究中使用的1μm圆柱形颗粒的图像代表性扫描电子显微照片。
说明药物释放粒子制造的光刻工艺流程图。
图3:展示药物释放粒子制造的光刻工艺流程图。

讨论

当前的药物递送一旦了解了微粒在体内外的命运,就可以朝着提高微粒给药技术的效率迈出重要的一步。然而,由于缺乏对大小、形状和表面化学的控制,药物在细胞内的传递和释放机制的操纵很难确定。本研究中使用的光学成像技术使我们能够完全控制大多数参数来制备粒子。我们已经能够合成定制的颗粒,这些颗粒符合我们对尺寸和形状的要求,可以用作药物运载工具。在当前的研究中,我们通过软光刻技术合成纳米颗粒,以便于使用不同的显微技术捕捉内部印刷颗粒的图像。利用生物成像技术可以精确监测药物在人类致癌细胞中的掺入情况。“同样,使用共焦显微镜、扫描电子显微镜(SEM)和流式细胞术进一步监测颗粒的内部化。图1描述了通过共焦显微镜将1μm带正电的印刷颗粒内化到HeLa细胞中。”为了有助于区分膜结合颗粒和被内化的颗粒,采用了不同的染色程序。“对粒子进行了三维重建,以进一步显示内化粒子及其在细胞内的位置。”(PubMed)

本研究获得的SEM显微照片清楚地显示了1μm正电荷印刷颗粒内化到HeLa细胞中,并在HeLa细胞中转运。同样,共焦显微镜和透射电镜都显示带正电荷的印刷颗粒转移到HeLa细胞的核周围区域,并且在60分钟的潜伏期后,观察到大多数内部化颗粒位于细胞的核周围区域。我们还观察到,正如我们通过共聚焦显微镜和扫描电镜获得的结果所描述的那样,有可能有一个以上的粒子被内化到一个细胞中。为了进一步了解曾经被内化的粒子的途径,在研究中使用了一系列抑制剂来检查正电荷印刷颗粒所采用的内吞途径(图2)。根据这项研究的结果,我们可以得出结论,细胞内大多数的粒子内化都是由于能量依赖的过程,观察到一旦细胞内的粒子内化发生了70%的减少/DOG应用于细胞的研究(desimone,2007),提示NaN/狗被证明阻断ATP合成的合成损害了细胞内能量依赖性转位。“有人认为,由于存在外源性ATP和葡萄糖,不能完成完全抑制。在本研究中,Dynasore被用作动态蛋白GTPase抑制剂来抑制网格蛋白包被的pit通路,并观察到该抑制过程中粒子内化减少约35%此外,在细胞内化的过程中,当颗粒物被抑制时,约为16%。“相反,我们观察到当使用小窝抑制剂菲利平时,内化率降低了2%。”(PubMed)结果表明,靶向和可控的粒子治疗可以成功实现。

因此,粒子内部化,再加上采用纳米成像技术的成像技术,已成功地应用于药物的制造、输送和释放监测,这些药物已被成功地纳入致癌细胞中,从而展示了不同技术和原理在医学研究中的协同作用。

工具书类

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  5. 詹妮弗·Y·凯利和约瑟夫·M·德西莫;形状特异,单分散的蛋白质颗粒纳米成型;美国化学学会杂志(2008)130,(5438-5439。
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  8. 威廉·R·亨迪、凯文·克利里、理查德·埃曼等;生物工程与影像学研究机会研讨会五:摘要(2008)生物医学工程年鉴,第36卷,第8期,。1315-1321年。

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